Skalenübergreifende Produktion und Sekretion rekombinanter Proteine mit Stämmen der Gattung Bacillus
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Sprache:Deutsch
37,00 €
inkl. gesetzl. MwSt.,
Beschreibung
Produktdetails
Einband
Taschenbuch
Erscheinungsdatum
04.07.2017
Verlag
Cuvillier VerlagSeitenzahl
138
Maße (L/B/H)
21/14,8/0,8 cm
Gewicht
189 g
Auflage
80. Auflage
Sprache
Deutsch
ISBN
978-3-7369-9576-5
Biopharmazeutika wie Antikörper und Hormone repräsentieren etwa ein Fünftel der kommerziellen Pharmazeutika. Für die rekombinante Produktion dieser Proteine sind diverse Stämme der Gattung Bacillus vielversprechende alternative Kandidaten. Sie sind einfach zu kultivieren, apathogen und sekretieren korrekt gefaltete Proteine mit hoher Effizienz. Einige der anspruchsvollsten heterologen Proteine sind Antikörper und ihre Fragmente sowie große multimere Enzyme wie die Penicillin-G-Acylase (Pac). Antikörperfragmente werden aufgrund ihrer hoch-spezifischen Antigen-Bindung vielfach therapeutisch, diagnostisch und analytisch eingesetzt, wobei single-chain fragment variable (scFv) das kleinste herkömmliche Format darstellt. Pac wird für die Herstellung semisynthetischer ß-Lactam-Antibiotika benötigt. Gegenstand dieser Arbeit ist die skalenübergreifende rekombinante Produktion und Sekretion des Antikörperfragments D1.3 scFv und der Pac mit B. megaterium, B. licheniformis sowie mit B. subtilis-Stämmen unterschiedlicher Protease-Aktivität. Die Produktion, Sekretion und Reinigung des D1.3 scFv wurde durch ein Plasmid ermöglicht, das einen Xylose-induzierbaren, für B. megaterium optimierten, Promotor und Sequenzen für das Signalpeptid SPlipA und einen fusionierten His6-Tag aufweist. Die Sekretion von funktionalem D1.3 scFv wurde für B. megaterium MS941, B. licheniformis MW3 sowie B. subtilis 168, DB431 und WB800N in einem angepassten Minimalmedium gezeigt. Skalenübergreifend erfolgte die Produktion in Mikrotiterplatten (1,25 mL), Schüttelkolben (150 mL) und Rührkesselreaktoren (2.000 mL). Es wurden extrazelluläre Konzentrationen von 15 130 mg L 1 erzielt. Für B. subtilis stiegen Menge und Stabilität des D1.3 scFv, je geringer die Protease-Aktivität des Stammes war. Für die rekombinante Produktion der Pac wurden ebenfalls Xylose-induzierbare Plasmide konstruiert. Die Sekretion konnte für B. megaterium MS941 und ATCC14945 sowie für B. subtilis 168 und WB800N im Schüttelkolben (150 mL) gezeigt werden. Die maximalen extrazellulären Aktivitäten betrugen 0,3 0,65 U mL 1, wobei die Protease-Defizienz in MS941 bzw. WB800N auch hier eine Aktivitätszunahme bewirkte. Ein fusionierter C terminaler His6-Tag wirkte sich negativ auf die Pac-Aktivität aus. Das hohe Potenzial von Stämmen der Gattung Bacillus für die rekombinante Produktion von pharmazeutisch relevanten anspruchsvollen Proteinen wie Antikörperfragmenten und großen multimeren Enzymen konnte skalenübergreifend von 1,25 bis 2.000 mL Kulturvolumen demonstriert werden. Mit 130 mg L 1 wurden die bisher höchsten extrazellulären Konzentrationen eines Antikörperfragments für ein Gram-positives Bakterium erreicht. Auch wurde die artübergreifende Anwendung der hier konstruierten, für B. megaterium optimierten, Plasmide demonstriert.
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